培养皿菌落计数方法

一、菌落计数方法

1、计数器测定法。

即用血细胞计数器进行计数。取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。

2、电子计数器计数法。

电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。

3、活细胞计数法。

常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。

4、比浊法。

比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。

5、测定细胞重量法。

此法分为湿重法和干重法。湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；

6、测定细胞总氮量或总碳量。

氮、碳是细胞的主要成分，含量较稳定，测定氮、碳的含量可以推知细胞的质量。此法适于细胞浓度较高的样品。

7、颜色改变单位法。

这种方法通常用于很小，用一般的比浊法无法计数的微生物。

二、全自动菌落计数器的使用方法及功能衍变

传统的菌落计数方法费时费力并且错误率较大，是一种全人工操作的方法。

现在随着科技的进步，菌落计数技术日趋完善。主要体现在配置越来越高，功能越来越全。计数的速度越来越快，准确性也越来越精准。具体体现在下面几个方面：

1、成像方面，传统的手动菌落计数器，使用的是放大镜，一般可放大1.7倍到3倍。现在使用的菌落计数器已经具有了图片拍摄功能，而且CCD的规格越来越高，现在市场上销售的仪器所配置的CCD规格是300万到1000万像素不等，分辨率也从原来的0.08mm增强到了现在的0.01mm，图像清晰度大大提高。另外应基层微生物实验室的使用需求，还增加了图像特性获取功能。

2、图像处理功能，具有图像调节，图像增强，图像滤波，边缘检测，形态学运算等，这些都是传统的菌落计数器所没有的。

3、在统计功能方面，不再局限于传统的数量统计。现在市场上出现的全自动菌落计数器，已经增加了一些智能识别技术，可全皿菌落统计，区域选择统计，鼠标点击统计，排污区域计数，直径分类统计，颜色识别统计等。更先进的全自动菌落计数器还带有自动杂质剔除，菌落粘连分割大肠杆菌技术等等。

4、测量功能和抑菌圈自动测量方面也是原来的菌落计数器所没有，更有先进的仪器已经具有了药敏分析功能。不过，这种菌落计数器多用在微生物实验室等数据要求较高的领域，价格也不便宜，市场价多在8，9万左右。

5、在数据库的处理方面，较传统的菌落计数器，增加了数据存储，智能查询，数据导出等，有的还可以设置操作者使用权限，数据修改权限设置等，使测量的数据更加安全。同时，还可以在线编辑，报表打印。

总之，随着科学技术的发展，菌落计数器也在不断的改进。需求者可以根据自己的计数侧重点进行选购.

三、菌落计数器如何使用

菌落总数检测一般步骤为：

采样—样品制备与稀释—倒平板—涂布平板—倒置培养—菌落计数—计算菌落总数

样品制备，需要对样品进行均质，根据客户需要检测的样品不同。WIGGENS提供不同的均质设备，如均质机，拍打式均质器等；

样品的稀释，国标中采用1:10的十倍稀释方法，SOCOREX提供各种手动精密移液器，瓶口分液器，移液管控制器为液体操作提供了保证。

倒平板，使用的培养基为含有琼脂的固体培养基。培养基在配备的过程中需要经过煮沸和保温的步骤。WIGGENS红外加热磁力搅拌器，直接使用红外辐射方式进行加热，1L培养基只需要10分钟即可煮沸，极大节约了客户培养基制备时间。在倒平板之前，需要恒温培养基46±1℃， WIGGENS恒温水浴锅，可以为用户提供的温度控制和恒温条件；

涂布平板，培养基在培养皿中冷却成固态之后，将稀释后的样品用移液器取1mL,滴到培养基表面，用涂布棒涂匀。WIGGENS有专用的培养皿转盘，可以有效的将样品液均匀的涂布在培养基表面。

倒置培养，将涂布完毕的平板，放入恒温培养箱中进行培养，一般培养时间约为48h。WIGGENS恒温培养箱内容积50-140L各种规格的台式及落地式培养箱，先进的设计及数据接口，可以直接通过电脑编程控制及信息处理，非常适合规范化培养要求。

菌落数计算，经过48小时的培养之后，在培养基表面会长出菌斑，每个菌斑代表一个微生物。一般在培养皿中菌落数为30-300个之间，为有效菌落数。低于30个，会因为样本量不足，随机性大；超过300个，会因为菌落数太多，过于密集产生菌斑重叠等现象，不利于准确计数。WIGGENS菌落计数器，是带有非闪烁式环形光源，放大镜，压力传感器，计数笔等，可以让使用者轻松计数。

计算菌落总数，培养皿中的菌落数需要通过公式换算。 WIGGENS菌落计数器，配套软件可以直接通过压力传感器进行培养皿中菌落计数，通过软件内嵌程序直接计算出被检测样品中菌落总数。

四、菌落总数的检测

平皿计数法

菌落总数(standardplate-countbacteria):水样在营养琼脂上有氧条件下37℃培养48h后，所得1mL水样所含菌落的总数。

仪器和装置

高压蒸汽灭菌器。

干热灭菌箱。

培养箱(36±1)℃。

电炉。

冰箱。

放大镜或菌落计数器。

pH计或精密pH试剂。

灭菌试管。

平皿直径9cm。

培养基与试剂

营养琼脂成分蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂10～20g、蒸馏水1000mL。

制法将上述成分混合后，加热溶解，调整pH为7.4～7.6，分装于玻璃容器中(如用含杂质较多的琼脂时，应先过滤)，经103.43kPa(121℃)灭菌20min，贮存于冷暗处备用。

检验步骤

1)水样处理。

a.饮用水。以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1mL充分混匀的水样，注入来菌平皿中，倾注约15mL已熔化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养充分混匀。每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照。

待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于(36±1)℃培养箱内培养48h，进行菌落计数，即为1mL水样中的菌落总数。

b.水源水。以无菌操作方法吸取1mL充分混匀的水样，注入盛有9mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成1∶10稀释液。

吸取1mL1∶10的稀释液注入盛有9mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成1∶100稀释液。按同法依次稀释成1∶1000、1∶10000稀释液等备用。如此递增稀释一次，必须更换一支1mL灭菌吸管。

用灭菌吸管取未稀释的水样和2～3个适宜稀释度的水样各1mL，分别注入灭菌平皿内。以下操作同生活饮用水的检验步骤。

2)菌落计数及报告方法。作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘2以代表全皿菌落数。然后再求该稀释度的平均菌落数。

不同稀释度的选择及报告方法:

首先选择平均菌落数在30～300者进行计算，若只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则将该菌落数乘以稀释倍数报告之(见表82.2中实例1)。

若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～300之间，则视二者之比值来决定。若其比值小于2应报告两者的平均数(如表82.2中实例2)。若大于2则报告其中稀释度较小的菌落总数(如表82.2中实例3)。若等于2亦报告其中稀释度较小的菌落数(见表82.2中实例4)。

若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表82.2中实例5)。

若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应以按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表82.2中实例6)。

若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300，则应以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表82.2中实例7)。

若所有稀释度的平板上均无菌落生长，则以未检出报告之。

如果所有平板上都菌落密布，不要用“多不可计”报告，而应在稀释度最大的平板上，任意数其中2个平板1cm2中的菌落数，除2求出每平方厘米内平均菌落数，乘以皿度面积63.6cm2，再乘其稀释倍数作报告。

菌落计数的报告:菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用两位有效数字;在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示(见表82.2“报告方式”栏)。

表82.2稀释度选择及菌落总数(CFU)报告方式