可食用酶(菊粉酶的概述)

一、菊粉酶的概述

世界上主要有3家企业从事菊粉的加工和销售，其中比利时的ORAFTI公司年处理菊苣40万吨以上，其次是Cosucra公司、荷兰的Sensus公司。国际市场的菊粉98%由这三家公司占据。2012年3月，全球最大的菊粉生产企业Beno-Orafti公司宣布，全球30多个国家的350多种食品中添加该公司生产的菊粉和果聚糖。

我国的菊粉产业刚刚起步。2009年3月25日，我国卫生部批准菊粉作为新资源食品。在此之前，甘肃、山西、湖北、宁夏、青海等地已有一些有眼光、有胆略的企业家投资菊粉产业，先后建成一定规模的生产线，开创了我国菊粉产业发展的先河。截至2012年，我国年生产菊粉5000吨以上。

长期研究推广菊粉产业的赛普特环保技术（厦门）有限公司总经理陈晓强对欧洲及国内菊粉市场有着相当深的了解，他认为，我国菊粉市场及产业发展与欧洲相比具有较大差距，国内菊粉生产企业对于市场应用及开发定位尚不够清晰，菊粉尚无相关国家标准，产品检测方法不明确，菊粉生产企业对菊粉衍生产品知之甚少。

尽管如此，国内菊粉产业仍然破土而出，顽强生长。不久前，赛普特环保技术（厦门）有限公司的技术团队刚刚为西北一家菊粉生产企业设计的菊芋菊粉生产线经过局部工艺调整，以成功加工出40吨以欧洲菊苣为原料的高纯度菊粉。此次的欧洲菊苣工业化验证生产获得成功，证明赛普特技术团队设计提供的菊粉生产线不仅适合于菊芋的生产，同时也可进行欧洲菊苣的生产。这为国内菊粉生产企业以菊芋原料为主、菊苣原料为辅生产高纯度菊粉或以菊苣原料为主、以菊芋原料为辅生产高纯度菊粉成为现实，在国内尚属首次。

上海博程膳食纤维发展有限公司总经理王延平对国内外膳食纤维市场及企业经营有着丰富的经验，他提醒国内菊粉企业：要让消费者知道菊粉是属于膳食纤维这一大类。因为消费者对膳食纤维已经有了大概的了解，这样让消费者认识菊粉就容易些；再有，要抓住益生元概念。菊粉还不是益生元中的主流产品，所以市场占有率低。他提醒菊粉市场企业，要紧扣国家营养标签规范这一契机。

2008年5月1日，国家营养标签卫生规范颁布实施，在这之前，有些添加膳食纤维的产品添加量为万分之五，非常少，但也宣称高膳食纤维食品。实施国家营养标签卫生规范，如要标称高膳食纤维的产品，则其中膳食纤维含量就要大于6%，规范食品加工企业达到一个有效量，从概念性添加走向功能性添加，这也给菊粉产业提供了机会。

对于企业如何做强，王延平根据自己企业的经验提出了看法。他建议：菊粉生产企业在成熟的市场，也就是出口市场去经受锤炼。他说，没有出口就难以实现国际化，没有把我们置身于发达国家百般的挑剔中，我们就难以成长。在出口的竞争中我们面对的就是国际领先产品的竞争，我们要接受发达国家成熟的市场对我们的各种各样的考核，我们要按照国际标准来行事，这是我们成长的捷径，也是我们走向国际化的必经之路。

产品出口的企业都知道，虽然我们做了各种各样的认证，但每次国际大客户都能提出新的问题，这些非常有助于我们的成长。另外，国外膳食纤维用量比国内大得多，走出出口这一关，也是我们迅速发展、扩大市场规模最好的办法。

王延平提醒有关企业：任何产品最终都不可避免地走向同质化，总有一天我们大家做菊粉的水平都差不多，等你能够替代国外产品的那一天，你就完成了惊险一跳。一旦我们进入国际市场，市场格局就会被我们重新定义。

国内主要菊粉生产企业有：定西陇海乳品有限公司、天门海力菊糖科技发展有限责任公司、山西益生元生物科技有限公司、白银熙瑞生物工程有限公司、张掖云鹏生物可以有限公司、中兴生物科技有限公司、青海威德生物科技有限公司。

国内主要菊粉生产企业的高管们一致认为，国内菊粉生产企业应同心协力把菊粉这个产业做大，并建立自己的组织，中国菊粉产业发展工作组已经成立，以进一步推广和落实菊粉产业发展政策，推进中国菊粉产业的发展。

二、菊粉酶的进展及应用

菊粉酶有不同的分类方法。

根据菊粉酶在微生物体内主要分布于细胞内、细胞壁和细胞外，分别称为胞内酶、胞壁结合酶和胞外酶，它们的比例主要受菌种、碳源、温度和ph的影响（ettalibi等，1990）：l）随着温度的升高胞外酶比例下降，而其他两种酶比例上升；2）以菊粉或蔗糖为碳源培养微生物时，前者胞外酶比例高于后者，其他两种酶则相反；3）胞外酶主要由真菌合成，细胞壁结合酶主要产自酵母；4）适当的ph使细胞壁通透性增大，提高了胸外酶比例，其他两种酶比例下降。

根据作用底物方式的不同，或者说根据菊粉酶酶切果聚糖链方式分为内切酶（ec3．2．1．7）和外切酶（ec3．2．1．80）。通常用i/s的大小来区分内切型菊粉酶和外切型菊粉酶，i是以菊粉作底物时的酶活，s是以蔗糖作底物时的酶活。一般认为外切菊粉酶的i/s值比内切菊粉酶的us低。内切菊粉酶水解菊粉可以得到高纯度低聚果糖，常由真菌分离出来。外切菊粉酶在胞内、胞壁、胞外都有分布，它水解菊粉可以得到高纯度果糖。

根据来源菊粉酶可以分为微生物菊粉酶和植物菊粉酶。

2．l热稳定性绝大多数报道中，菊粉酶的最适温度为52～64℃之间，55～58℃最适宜。

2．2ph值对活力的影响菊粉酶最适ph为弱酸性，这一性质不仅操作安全，而且使用过程中可以防止微生物污染，也是果糖最稳定的ph值。

2．3底物专一性李俊刚等（1999）认为，提高菊粉酶酶解效率的关键在于提高酶活和增加底物对酶作用的敏感性。据研究报道，菊粉酶不仅可以对菊粉作用，也可以对蔗糖及棉子糖作用，并表现出更高的活力和水解能力。使用菊芋提取液或菊粉做碳源，都能诱导产生菊粉酶，但菊芋提取液作底物效果更好。这可能是因为提取液除含菊粉外，还含有较多的短链的多聚果糖，更有利于菌体的生长以及被酶水解（pramod等，1991）。也就是说，一定的底物可以诱导生成菊粉酶，但用不同的碳源作底物对酶的活性影响很大。研究发现一定浓度的菊粉、麦芽糖和低浓度的果糖能够诱导生成菊粉酶，淀粉对菊粉酶的影响不大，葡萄糖却能明显地抑制菊粉酶活性。表明菊粉酶有底物专一性。

菊粉酶的来源很广，自然界中的植物以及土壤、水和动物消化道中的多种微生物都可以分泌菊粉酶。微生物来源的菊粉酶种类多，热稳定性好，适于发酵生产。据不完全统计，产菊粉酶的有丝状真菌17个属物余种，酵母菌10个属20余种，细菌12个属10余种。目前有不少研究人员仍在致力于筛选新的产酶菌种，并对现有菌种进行改造，以得到高酶活、热稳定性好的生产菌株。大多数微生物菊粉酶均为外切型菊粉酶，并且常常呈现出转化酶活力，转化酶是一种水解蔗糖为葡萄糖和果糖的酶，对葡粉没有作用。

菊粉酶的纯化步骤一般分为：（nh4）2so4沉淀、离子交换层析及凝胶过滤色谱等。离子交换层析可用来选择性地分离外切型菊粉酶和内切型菊粉酶，通常用naci进行线性梯度洗脱，随着na－ci浓度增加，内切菊粉酶先洗出，外切酶后洗出（azhall等，1989）。菊粉酶的提纯过程：在0℃条件下，用40%饱和硫酸铵除杂蛋白，用90%饱和硫酸铰析出菊粉酶，用sephadexg25脱盐，聚乙二醇透析浓缩；再进行sophadexg200层析，操作温度10℃；然后进行deae一纤维素de52离子交换层析；最后4℃、120v恒压电泳分离（贾英民等，1998）。

常见的酵母和真菌中分离的酶多同时具有菊粉酶和转化酶活性，为区分两者，人们常采用“e=菊粉酶总酶活+转化酶总酶活”的公式，当e>0．02为菊粉酶，e<0．02则为转化酶。菊粉酶酶活定义为在一定的反应条件下每分钟释放lμmol果糖所需酶量；转化酶酶活定义为每分钟水解1μmol蔗糖所需的酶量。由于测定菊粉酶酶活的定义没有统一标准，因此酶活的单位也有不同。

6．l酶液的制备胞外菊粉酶粗酶液的制备：将发酵液过滤或离心即可得粗酶液。胞内菊粉酶粗酶液的制备：取一定量的发酵液离心后得菌体，将菌体用0．lmol/lph值为5．6的醋酸缓冲液洗涤2～3次后，加缓冲液至原体积，然后用超声波处理（10khz，100w，5min）菌悬液，处理液即为胞内菊粉酶粗酶液（肖春玲，1999）。

6．2酶活测定黎明兰等（1995）用菊芋提取液做培养基。发酵后取0．05ml发酵液加4．5ml5%菊粉液，55℃反应30min，沸水浴煮10min终止酶活，在同样的反应系统和条件下加入沸水浴煮10min的酶作空白对照。取一定量反应液用费林试剂热滴定法测糖（北京大学生物系生物生化教研室，1986）。酶活单位定义为：在上述反应条件下生成lμmol/min还原糖所需酶量为1个酶活单位。

uhm等（1987）报道的方法是，取50μl适当稀释的酶液，加入450μl5%的菊粉（0．lmol、ph4．5的醋酸缓冲液配制），60℃保温10min，沸水浴5min，灭活终止反应（在完全相同的条件下灭活酶底物作对照），快速冷却后，用somogi-nelson法（derycke等，1984）测定还原糖。陈晓明等（2000）测定酶活时与uhm的方法不同的是，用3、5－二硝基水杨酸比色法测定还原糖数量，酶活单位定义为：在上述反应条件下，每分钟催化菊糖水解生成lμmol还原糖的酶量。

7．l利用菊粉酶生产高果糖浆由于高果糖浆价格低廉，味甜，爽口，渗透压高，保藏效果好，热值低，不易造成龋齿，而且糖尿病患者可利用，所以在美、日等发达国家被广泛用于食品和医药工业。20世纪70年代以后，各国开始关注以菊粉为原料，以酸法和酶法水解制备果糖。酸法虽然产量高，但副产物多，色素重，分离精制难。80年代，美国、法国人b利时、加拿大等国的研究人员开始研究利用菊粉酶制果糖，其工艺简单，转化率高，产物纯，果糖产量高，可直接生产超高果葡糖浆（uhfgs），果糖含量90%以上。为此美国、英国、丹麦、法国、加拿大等发达国家都在进行研究。由此可见菊粉酶在果糖及果葡糖浆的生产上具有巨大的开发应用潜力。外切菊粉酶降解产物以果糖为主且果糖比例高。菊粉酶生产高果糖浆的研究国内外都较多，我国对其研究还处于起步状态。

7．2利用菊粉酶生产低聚果糖低聚果糖是一种良好的双歧因子和水溶性膳食纤维，有防治便秘、抑制肠内腐败物质形成、提高机体免疫力、改善脂质代谢、降低胆固醇等作用，同时适于糖尿病人食用。比利时orafti公司投资20亿比利时法郎，历时数十年种植菊艺开发生产低聚果糖和菊粉，分别作为食糖和油脂代用品（胡学智，1997）。日本明治制果也在大规模生产。中国食品发酵研究所、上海医药工业研究所等已经试制成功，正在扩大试验中。工业上生产利用菊粉酶生产低聚果糖的方法是由内切型菊粉酶水解菊粉而成，产物以低聚果糖为主，纯度高，原料便宜，低聚果糖已被视为食品原料，而非食品添加剂。

7．3利用菊粉酶生产酒精利用菊粉酶生产酒精，国外相关研究较多。国外有报道指出，用aa-pergillusniger（schorr-garlindo等，1995）、k．fragilis（ohta等，1993）或k．margaritis（margantis等，1982）发酵菊粉生产酒精，aspergll。niger转化率为明%以上（v/v），后两者几乎能完全将菊粉发酵成酒精。发酵粗菊芋提取液，不需加其他营养物质，25h内酒精产量87．8%。

7．4其他方面的应用菊粉酶还可直接发酵菊粉制备各种产品，如可制备丙酮丁醇，用于诊断肾脏疾病，控制血糖升高。另外，严奉伟等（1999）已经开始进行菊粉软糖的试制。利用菊粉酶直接发酵菊粉，制作功能性食品和饲料添加剂将有巨大的生产开发潜力。

我国在菊粉酶的研究和应用中遇到的主要困难是：l）产酶成本高，导致应用成本高。主要表现在产酶菌株的菊粉酶产量低，提高了应用成本，制约了低聚果糖在食品工业和饲料工业中的应用。2）菊粉酶酶活测定及酶活力单位在定义上不统一，不利于研究者之间的交流和沟通。酶活力的测定方法对确定菊粉酶活力水平、特异性及归类有重要意义。但在菊粉酶活力测定方法及酶活力单位定义上尚未统一。多数菊粉酶活力测定报道，是以不同聚合度、纯度和浓度的菊粉或蔗糖做底物，测定反应混合物在一定时间内还原糖的增加量。另外，内切型菊粉酶的酶解产物多为低聚果糖和少量果糖，所以按现有的酶活测定法及酶活定义，其酶活水平将普遍比外切型菊粉酶低。因此测定和活力单位定义标准的统一是急需解决的问题

三、菊粉酶的介绍

菊粉酶（inulinase）是能够水解β－2，l－d一果聚糖果糖苷键的一类水解酶，分泌菊粉酶的微生物在自然界中分布很广，土壤、水和动物消化道中的多种微生物都能分泌。菊粉酶可以在一定的温度条件下水解菊粉成果糖或低聚果糖。

四、菊粉酶的由来

菊粉最早是从菊科植物中分离出来而得名。菊粉（inulin）是一种有呋喃构形的d一果糖经β-2，l糖苷键脱水聚合而成，且在果糖残基（f）末端连有一个葡萄糖残基（g）的直链结构多糖，是最简单的一类果聚糖，简写为gfn（edelman等，1968）。此外，emst等（1995）报道，菊粉还含有少量另一类果聚糖（inulonose）即末端无连有g的果聚糖。

菊粉又称菊糖，来源于菊芋、菊苣等植物，是一种功能性果聚糖，也是最易溶解的水溶性膳食纤维。菊粉作为一种纯天然的功能性配料，已被世界20多个国家批准为营养增补剂，广泛运用于乳制品、饮料、低脂低热量食品、烘培食品、保健食品中